简述全内反射荧光显微术的原理和应用 实
房克凤
摘要 “荧光显微术原理及应用”是基于北京农学院现有研究生课程的基础上面拟向农业生产类、生物专业、动物专业以及园林专业的硕士研究生设置的选修课，其目的在于为研究生进行正式学术研究打下一定的实验技术基础。主要讲述体式荧光显微镜、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜的原理及应用。根据学校新修改的研究生课程设置的精神，进行精讲多练。总27学时，其中7学时理论，20学时实验。通过本课程的开设，使得研究生能够掌握体式荧光显微镜、荧光显微镜以及激光扫描共聚焦显微镜的原理和使用，为科研工作的顺利进行打下坚实的基础。
关键词 荧光显微术 课程 教学 思考
中图分类号：G424 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.05.074
“荧光显微术原理及应用”是一门非常重视实践性的技术基础课。“荧光显微术原理及应用”是基于北京农学院现有研究生课程的基础上拟向农业生产类、生物专业、动物专业以及园林专业的一年级硕士研究生开设的公共选修课，希望通过该课程的开设，为研究生开展学术研究奠定一定的实验技术基础。该课程对于研究生掌握科学研究中的细胞生物学观察方法，培养学生独立进行科学研究的素养和能力具有重要作用。作为新开研究生课程，基于北京农学院的实际情况对“荧光显微术原理及应用”的教学与实验进行了如下设置及思考。
1“荧光显微术原理及应用”课程开设的必要性
1.1研究手段和技术的发展的需要
物质吸收电磁辐射后进入激发态，而受到激发的原子或分子在去激发过程中再发射波长比激发光波长更长的光，这种再发射的光称为荧光。生物体内有些物质有自发荧光，如叶绿素或细胞壁的某些成分，受紫外线照射后发出荧光；生物体内大部分物质本身不能发出荧光，但如果用特异性的荧光染料标记后，经紫外线或其他波长的光照射后也可以发出荧光，这种荧光可以被荧光显微镜捕获，并进行定量分析。因此，荧光显微术就是基于荧光对这类物质进行研究的技术。荧光显微镜依据观察物体大小及原理又可以分为多种。常用的有体式荧光显微镜、荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜等等。
体视荧光显微镜能对微小样品进行快速、清晰的显微观察，并实现完全无漂移的三维立体成像，配有较长的工作距离，不仅能够获得较大的景深和光学细节，还能保证样品的真实色彩；对样品能进行实体测量；具有良好的操控系统，可提供优良的重复性从而使实验过程简化。但是体式荧光显微镜有缺陷性。其放大倍率较低，适合于研究对象的整体观察和活体观察以及一些较大的器官和组织的观察，不适合观察小组织或细胞。
与体式荧光显微镜相比，荧光显微镜放大倍数较高，工作距离较短。可以观察更多的细节。能在组织、细胞和亚细胞的水平上研究细胞内物质的定位、营养成分的吸收、运输，以及化学物质的分布及定位等。可以进行活体或固定材料的观察。
激光扫描共聚焦显微镜是上个世纪80年代发展起来的一种非常精密的仪器设备。它以光学为基础，将机械、电子、计算机等融为一体。与体式荧光显微镜和荧光显微镜不同，激光共聚焦以激光为光源，可以把标本分成多个光学断层，逐层进行扫描并成像，因此是一种新显微层面的研究手段。此外，由于激光共聚焦显微镜对细胞和组织连续光学切片无损伤，而且能够对活体细胞进行实时的动态观察，使它在生物科学的研究中占有独特的地位。目前，人们已广泛应用该技术来观察和分析细胞内的微细结构和分子在细胞内的分布，例如细胞内游离钙、活性氧、转录因子、表面分子、细胞凋亡、细胞膜流动性、胞内分子的运动、细胞间的缝隙连接、蛋白问的相互作用等方面。
传统的荧光显微镜配备的是胶卷相机，胶卷的冲洗非常复杂、耗时耗力。随着科学技术的发展，数字成像系统也应用到荧光显微术上。其中电荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）就是与荧光显微镜密切相关的数码摄像产品。它能够将荧光显微镜拍摄的显微摄影产品通过USB接口传输到电脑中，便于图像的采集研究。随着技术的进一步发展，分辨率也越来越高，因此通过CCD，可以拍摄到分辨率更高的图片。
1.2课程设置的需要
根据本校研究生现有课程以及科研工作的需要，特开设“荧光显微术原理及应用”。现有的课程“植物显微技术”注重石蜡切片，尤其是实验环节甚少涉及显微镜；而现有的“电子显微镜”课程主要讲述超薄切片和透射电镜以及扫描电镜的原理及使用。因而“荧光显微术原理及应用”课程的开设，填补了两者之间的空档，能够更好地为广大教师和研究生的科学研究工作服务。
1.3科学研究的需要
随着学校教师科研项目的增多、科学研究的深入，越来越需要使用相应的技术手段，例如研究特定基因功能，需要进行转基因验证，一般加入GFP，YFP等报告基因，此時需在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察将基因表达的蛋白进行定位并分析。
1.4现有实验平台的支持
北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室下设三个研究平台，其中显微平台具备体式荧光显微镜、倒置荧光显微镜、正置荧光显微镜和Leiea的激光扫描共聚焦扫描显微镜等大型仪器设备，为本课程的顺利开设提供了物质基础。
1.5教辅人员的配备
开设本课程的教师具有多年教学经验以及多年管理体式荧光显微镜、正置荧光显微镜、倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等设备的经验，为本课程的顺利开设奠定了理论和实践基础。
2安排合理的教学和实验内容
2.1理论与实践相结合的教学理念
荧光显微术具有非常强的技术性和应用性，但理论知识的学习也是必不可少的。掌握了理论知识，能够促进实践应用。利用荧光进行显微观察的显微镜有许多种，根据本校的设备基础结合教师们的研究需求，重点选择体式荧光显微镜、荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等内容。首先，要进行相关的理论讲解，使研究生们掌握理论基础，在此基础上设计一些独立、完整的小实验，使学生能够掌握相应仪器的使用方法。例如利用体式荧光显微镜进行转基因材料的鉴定。体式荧光显微镜具有较大的景深，能够非常方便地观察转绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的转基因材料，如草莓、番茄、板栗、海棠、百合、玉米等。大大简化了原来在显微镜下观察的繁琐的前处理过程。
2.2选择合适的教学内容
根据研究生的研究需求结合学术发展的进展，选择合适的教学内容。理论课程内容主要分为五个部分。第一部分显微镜的发展简史。包括显微镜的发展，荧光的发现、发展、选择及使用、荧光蛋白的发现、发展和使用等等。第二部分为体式荧光显微镜，包括其理论及应用。第三部分为荧光显微镜，包括理论及应用。第四部分为激光扫描共聚焦显微镜的理论和应用。第五部分：其他荧光显微技术，如更为先进的双光子荧光显微镜、转盘激光扫描共聚焦显微镜等内容。
2.3设置合理的实验内容
教学中想尽办法引导学生把理论知识和其自身的科学研究有机结合，提高学生的兴趣和对知识的掌握能力。基于本校农业应用新技术北京市重点实验室显微平台的仪器设备配置情况，结合研究生研究课题的需求，设置相应的较为系统性的小实验。
体式荧光显微镜因其景深较大，可以观察较大的实验材料。例如可以观察本校不同研究团队的转基因材料以及较大的组织块等。前期已经成功观察到了根的转基因荧光。
荧光显微镜观察花粉管内囊泡运输。首先需要选择合适的花粉。不同物种的花粉其萌发时间及生长速度差异巨大，要选择生长速度合适的花粉。首先要培养花粉管，其次用荧光染料FM 4-64标记囊泡，在此过程中需要学生分组合作，配置所需试剂，随后在显微镜下观察花粉萌发及花粉管生长情况。接着选择合适的花粉管，用荧光染料FM 4-64标记囊泡，随后在荧光显微镜下观察囊泡运输情况并采集图像，利用软件对荧光进行定量分析，得出相应结论，撰写实验报告。
利用激光共聚焦显微镜采集花粉管内游离钙离子信号。植物细胞因具细胞壁，钙离子标记较為复杂，时间较长，能够锻炼研究生的动手能力。花粉管培养完毕后用Fluo 4 AM标记钙离子，用xyt的模式观察钙离子的动态变化，利用软件进行荧光定量分析，得出相应结论，撰写实验报告。
3考核方式的探索
根据本门课程注重实验的特点，以及出于对学生基本实验技能、创新意识、创造性思维、科学思想、科学态度等进行全面评价，总成绩评定由三部分组成：（1）上课及参加实验的考勤（占30%）；（2）自己制作并进行显微观察的图片质量（占40%）；（3）实验报告写作及其对实验中出现问题的分析情况（占30%）。课程论文内附有学生自己拍摄的自己制作的切片的显微照片，以及对照片出现的问题分析。
4结语
“荧光显微术原理及应用”课程的特点是具有非常强的实践性，对学生的科学态度、动手能力及分析问题和解决问题的能力要求较高。因此，为了让学生在较短的时间内接受严格的正规训练，整个实验过程让学生独立操作，最后获取图片后，对样品内容、样品质量和图片质量进行综合分析，最后完成实验报告，能够较大地提高了研究生进行科学研究的综合能力。
