液的作用:肉桂体外及体内试验,... 体内试验肉桂水煎剂也无抗凝作用...
文丽君++尤晓光
摘 要：以固相合成法合成VEGF125-136小肽及随机小肽，并用ELISA实验检测其活性；同时用CY5.5标记VEGF125-136小肽，并进行细胞荧光实验，从而为进一步的靶向对比剂的合成及影像诊断提供物质基础。
关键词：VEGF125-136小肽 CY5.5 固相合成 靶向
中图分类号：R73 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）09（b）-0199-04
VEGF是最主要的血管生成促进因子，在人类的多种肿瘤中均有过度表达[1]，其中VEGF165促进肿瘤细胞生长及瘤区血管生成作用最大[2]。细胞膜上的VEGF受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2，简称VEGFR 2）高表达于肿瘤新生的血管内皮细胞及多种恶性肿瘤细胞表面膜上（如鼻咽癌、喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肾上腺皮质腺癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病等），而在其它细胞中表达极低或不表达。因此，VEGFR2（KDR/flk-1）成为肿瘤靶向成像研究的重要靶点之一。
VEGF外显子6编码的12肽QKRKRKKSRYKS，经研究证实，与KDR结合的能力最强，由于此小肽体内无生物学活性，具有良好的组织渗透性、代谢稳定性及可耐受多种修饰等特点[4]，可与VEGF165竞争肿瘤新生血管内皮细胞及多种肿瘤细胞膜上VEGFR-2受体结合位点，故小肽QKRKRKKSRYKS有可能取代VEGF分子用于肿瘤的靶向显像研究。本文以固相合成法合成实验组VEGF125-136小肽QS及对照组随机小肽QK，并用ELISA实验检测其活性，同时用CY5.5标记VEGF125-136小肽，并进行细胞外靶向实验，从而为进一步的靶向对比剂的合成及影像诊断提供物质基础。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
Wang树脂（吉尔生化上海有限公司）；Fmoc保护氨基酸单体（吉尔生化上海有限公司）；1-羟基苯并三氮唑（HO Bt）、2-（1H一苯并三氮唑1，1，3，3一四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、N，N一二异丙基乙胺（DIPEA）、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、N，N一二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）（阿拉灯试剂）哌啶、无水乙醚、甲醇（西亚试剂）；VEGFR一抗（abcam）；辣根过氧化物酶标记的VEGFR二抗（abcam）；显色液（Novobio）；96孔酶标板（spl）DMEM高糖培养基（Sigma）；胎牛血清（Sigma）；BEL-7402细胞（ATCC）；细胞培养瓶（Sigma）；细胞爬片（北京凯乐思科技有限公司）；相合成器（杭州欧尔柏维科技有限公司）；离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；Agilent1100-Bruker Esquire HCT型液相色谱仪（美国布鲁克公司）；X Series（X7）型电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞世尔公司）；酶标仪（美国biotek酶标仪）；CO2恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；inVia Reflex型共聚焦荧光显微镜（Renishaw公司）。
1.2 VEGF125-136小肽及随机小肽合成
VEGF125-136小肽（QS：Gln-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Tyr-Lys-Ser）的合成：选取Fmoc-ser（tbu）-wang resin的树脂1.0g，放入固相合成器内，加入10mL DFM，通氮气搅拌2h，抽滤；加入20%哌啶5mL，通氮气搅拌5min，去除树脂上的FMOC保护基团，抽滤后分别加入DCM与DFM 5mL清洗，Kaiser试剂检测氨基托保护情况，所用树脂变蓝或黑色表明托保护充分；接第二个氨基酸：称取C端第二个氨基酸FMOC-lys（boc）-OH，检测氨基托保护，抽滤后加入缩合剂HBTU 0.660g
（1.74mmol，379.24g/mol）和HOBt 0.235g（1.74 mmol，135.13g/mol），溶于10mL DMF中，再在该溶液中加入DIEA 0.449g（3.48mmol，129g/mol），通氮气搅拌2h，抽干Kaiser试剂检测，所有树脂变为白色或淡黄色表明反应完全，如还有树脂为黑色或蓝色，表面反应不充分，重复接第二个氨基酸，直至所有树脂变为白色或淡黄色为止；接后續氨基酸：Fmoc-Tyr-OH，Fmoc-Arg-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Lys-OH，Fmoc-Lys-OH，Fmoc-Arg-OH，Fmoc-Lys-OH，Fmoc-Arg-OH，Fmoc-Lys-OH，Fmoc-Gln-OH，抽干Kaiser试剂检测，所有树脂变为白色或淡黄色表明反应完全；DFM清洗三次，加入甲醇5min2次，抽干备用；取0.2g树脂TFA96.5%+triisobutylsilane1.0%+water2.5%2mL反应5h，取烧瓶加入乙醚真空抽滤沉淀，HPLC纯化，离心后质谱检测。
同样方法合成随机小肽（QK：Gln-Lys-Tyr-Ser-Lys-Gln-Lys-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys）。
1.3 VEGF125-136小肽QS及随机小肽QK活性检测
取微球小肽QS：Gln-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Tyr-Lys-Ser及QK：Gln-Lys-Tyr-Ser-Lys-Gln-Lys-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys各100mg入多肽合成管内。用1%BSA 2mL封闭，室温2h；抽滤后，加入VEGFR一抗20ug/200mL，37℃，孵育2h；加入PBS 5mL，多次抽滤后，加辣根过氧化物酶标记的VEGFR2二抗20ug/200mL，37℃水育1h；多次抽滤后，加入PBS 5mL，实验组与对照组移液器各取100uL入96孔酶标板内；每孔加底物A与B液各50uL，37℃水育15min（避光）；50ul终止液终止反应；于450nm处测定OD值，判断阴阳性结果。endprint
1.4 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-随机小肽合成
将103mgVEGF小肽（QKRKRKKSRYKS）与125mg随机小肽（QKYSKQKKSSQKQK）放入固相合成器中标记A与B，锡纸包好，piperidine氨基脱保护3次；于每管内加CY5.5-NHS25mg，DIPEA500uL，室温反应3h（400转/分）；真空抽滤，DCM与DMF清洗3次；TFA96.5%+triisobutylsilane1.0%+water2.5%5mL反應5h；取烧瓶A与B加入乙醚真空抽滤沉淀VEGF小肽与随机小肽。；HPLC洗脱纯化：0～10min，20～40%乙腈，10～25min，40%～98%乙腈；LS/MS的洗脱条件80%乙腈，0～1min，干燥。
1.5 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-随机小肽体外靶向实验
1.5.1免疫荧光实验检测BEL-7402肝癌细胞VEGFR2受体表达情况
取对数生长的BEL-7402肝癌细胞，0.25%胰酶消化后制备单层细胞爬片；PBS冲洗爬片2次，4%多聚甲醛室温固定10～15min，吹干；PBS冲洗4次后加入0.1mmol/mL30uLFITC-VEGFR-2抗体，37℃避光温育2h；PBS漂洗4次，DAPI（1∶2000）复染细胞核5～10min；PBS漂洗4次，在玻片上滴加一滴防荧光猝灭剂，盖玻片封片，激光共聚焦显微镜观察VEGFR-2受体表达情况。
1.5.2 细胞荧光实验检测CY5.5-VEGF125-136体外靶向性能
制备BEL-7402细胞爬片同上，一组实验组、一组对照组；实验组加CY5.5-QS0.1mmol/mL30uL，对照组加CY5.5-QK30uL，避光37℃细胞培养箱培养2h；所有爬片PBS漂洗4次，DAPI（1∶2000）复染细胞核5～10min；所有爬片PBS漂洗4次；在玻片上滴加一滴防荧光猝灭剂，盖玻片封片；激光共聚焦显微镜观察各组细胞荧光成像异同。
2 结果与讨论
2.1 VEGF125-136 QS小肽QS及随机小肽QK小肽质谱分析
固相合成的VEGF125-136 QS小肽为白色粉末，测质谱得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量为605.80，与VEGF125-136小肽理论分子量1815.87相符；固相合成的随机小肽QK为白色粉末，测质谱得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量为564.10，与随机小肽QK小肽理论分子量1689.95相符，这说明合成产物为目标物。
2.2 VEGF125-136小肽及随机小肽的活性检测
本次采用的验证其活性的ELISA实验，与传统的 ELISA实验不同，这也是本研究的创新之处。由于小肽在微球上，是树脂小肽，无法进行抗体的传统96孔酶标板包被，但以多肽合成管为反应容器，每步反应后滤液恰好可用抽滤从多肽合成管中吸出，而树脂小肽被滤膜隔离留存在多肽合成管内，进行下一步反应。本次ELISA实验，两样本独立t检验发现实验组对照组吸光值差异有显著性意义，实验组吸光值较对照组明显增高，说明合成的VEGF125-136小肽具备结合VEGFR2受体活性，这是用于后续靶向对比剂合成的前提与基础（如表1）。
2.3 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-随机小肽质谱分析
Cy5.5-QS经HPLC分离纯化、分析见其主峰单一明显，杂质少，保留时间15.35min。测质谱得其主峰（m/z： [M+3H]+）分子量为720，与QS-Cy5.5小肽理论分子量2157.16相符；Cy5.5-QK经HPLC分离纯化、主峰保留时间10.025min。根据HPLC面积计算产物纯度为70.25%，测质谱得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量为690，与QK-Cy5.5小肽理论分子量2067.94相符。
2.4 BEL-7402 细胞体外靶向实验
细胞免疫荧光实验显示BEL-7402细胞膜表面有大量绿色荧光，VEGFR2受体阳性（如图1）。体外细胞荧光靶向实验显示BEL-7402实验组细胞膜有大量靶向红色荧光物质CY5.5-QS（如图2），BEL-7402对照组未见明显红色荧光CY5.5-QK（如图3）。细胞荧光实验表明CY5.5-VEGF125-136小肽体外可靶向BEL-7402细胞膜VEGFR2受体荧光显像，CY5.5-QK随机小肽无体外靶向成像作用。
3 结语
本文通过固相合成法成功合成VEGF125-136小肽及CY5.5-VEGF125-136小肽，并创新性的利用ELISA实验来检验VEGF125-136小肽的活性，结果表明该小肽具备结合VEGFR2受体的活性，这是用于后续靶向对比剂合成的前提与基础。同时细胞荧光实验表明CY5.5-VEGF125-136小肽能靶向BEL-7402细胞膜VEGFR2受体荧光显像，这为进一步的靶向对比剂的合成及影像诊断提供物质基础。
参考文献
[1] Wang L，Liu X，Wang H，Wang S.Correlation of the expression of vascular endothelial growth factor and its receptors with microvessel density in ovarian cancer[J]. Oncol Lett，2013，6（1）：175-180.
[2] Perroud HA，Rico MJ，Alasino CM，et al. Association between baseline VEGF/sVEGFR-2 and VEGF/TSP-1 ratios and response to metronomic chemotherapy using cyclophosphamide and celecoxib in patients with advanced breast cancer[J]. Indian J Cancer，2013，50（2）：115-121.endprint
