害虫生物防治技术基础与应用
殷玥 李媛媚 黄娟 开振鹏 周昌艳 陈珊珊
【摘 要】本文介绍了三代基因编辑技术ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9的作用机制和技术关键，对利用基因编辑技术进行昆虫研究相关的靶标选择案例与实际应用实例进行介绍。针对各项实际案例的研究结果，系统地对这项技术可能出现的问题进行分析阐述，展望其在害虫防治方面的应用前景。
【关键词】基因编辑；害虫防治；CRISPR/Cas9
Genome editing and its application in pest control
YIN Yue1，2 LI Yuan-mei2 HUANG Juan3 KAI Zhen-peng2 ZHOU Chang-yan1 CHEN Shan-shan1
（1.Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Institute for Agrifood Standards and Testing Technology， Shanghai201403，China；
2.Shanghai Institute of Technology， College of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai 201400，China；
3.Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China）
【Abstract】This review introduced the genome editing technology and summarizes the application of genome editing in pest control. Then the accounts of prospects and challenges for the use of these technology for pest control were presented. This review provided the reference for the further application of genome editing in pest control.
【Key words】Gene silence； Genome editing； Pest control
0 前言
每年，由于害蟲带来的经济损失和用来控制害虫的杀虫剂花费都高达上百亿元。同时，杀虫剂的长期使用也会带来污染和抗药性等诸多问题。害虫的安全、有效防治一直是植物保护研究中的主要关注点。
基因技术很早就被昆虫学家作为研究的重要工具。前期主要采用化学诱变剂和辐射等方式。自1980年转座子发现以来，人们对于昆虫基因的靶向修饰变得越来越方便和精确。通过基因的重组和编辑能达到以低毒的方式对害虫的数量进行控制。目前常用技术主要包括：转基因和基因编辑技术。转基因技术已发展的较为完善，并已广泛运用在植物保护中。近年来，基因编辑技术得到了极大的发展。人们通过注射的手段将外源基因导入到昆虫体内，敲除、修改或加入某种特定基因，从而影响其正常生长。基因编辑技术应用在诸多昆虫上都得到了较好的验证效果。通过基因层次的改造对害虫生长发育进行调控为人们提供了一套安全有效的害虫防治方法。
本文就基因编辑技术ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9的概况及在害虫防治方面的应用进行综述。
1 基因编辑技术概况
第一代基因编辑技术采用锌指蛋白核酸酶（ZFN）。它是一种人工改造的核酸内切酶，结合在DNA的特定位点，由非特异性核酸酶剪切，实现在DNA特定位点的定点断裂。第二代基因编辑技术采用植物病原菌黄单胞菌属（Xanthomonas）分泌的蛋白激活因子样效应物核酸酶（TALENs）识别特异性的DNA碱基对，并与之结合进行切割，导入新的遗传物质。尽管相比于ZFNs，TALENs要更加简便，但仍需要大量的基因合成和建构。第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒的进攻所演化而来的获得性免疫防御机制。与ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR/Cas9基因编辑不需要重复的设计和表达Cas9蛋白，只需要产生目的特异性的向导RNA（gRNAs）与Cas9蛋白结合。近期，针对CRISPR-Cas9 技术的脱靶效应，加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德纳研究团队证实，抗 CRISPR 蛋白AcrllA4能将脱靶效应降低四分之一，而整个过程中目标位点的基因编辑没有受到丝毫影响。
2 基因编辑技术在昆虫研究领域的进展
ZFNs在鳞翅目、直翅目、双翅目昆虫中都成功实现了基因编辑。Merlin C等人[1]以黑脉金斑蝶的Dpcry2基因为靶标，通过体外合成的mRNA注射，成功实现了基因敲除，在细胞S期的敲除率最高可达88%。McMeniman等人[2]以埃及伊蚊的AaGr3基因为靶标，不仅实现了基因敲除，还进行了基因片段插入的实验，结果得到基因敲除的率达到43.8%，插入的结果仅为0.49%。但在果蝇中，Rosy基因的插入实验成功率可达到60%[3]。基因的插入和敲除在细胞周期的不同阶段得到的结果也不同。由于设计有效的ZFNs存在困难，且成本较高，目前在昆虫研究上应用较少。
TALENs技术在鳞翅目、直翅目、双翅目昆虫的基因编辑中都有成功的案例。Xu等人[4]以家蚕为研究对象，以性别决定相关基因为靶标，整合包含系统组件的相关基因，基因敲除率达到100%。除了转基因的方式，TALENs也可以通过注射体外合成的mRNA进行基因敲除，在埃及伊蚊中敲除率可达到90%[5]。
CRISPR/Cas9系统虽然才被人们发现不久，但已经受到诸多研究者的关注。目前研究对象主要包括鳞翅目、直翅目、半翅目昆虫。目前，人们对于提高基因编辑效率采用了三种不同的方案：（1）引入质粒载体，体外编码Cas9的RNA和sgRNA[6]；（2）注射质粒sgRNA相关DNA到转基因后的果蝇体内[7]；（3）建立一个包含Cas9-sgRNA的转基因模型[8]。根据比较，Shih-Ching Lin得出了建立生物模型更为高效的结论。Gratz SJ等人还尝试将该系统与Cre-loxP系统联合使用，筛选效率更高。该系统关键在3xP3-RFP基因，相比于过去的基因插入技术，Cre-loxP与CRISPR/Cas9联用能有效提高基因编辑的成功率，为解决脱靶率高这一问题提供了解决手段。Honglun Bi等人[9]以鳞翅目害虫斜纹夜蛾为研究对象，利用Cas9对其Slabd-A基因进行编辑，最终成功地抑制了该基因的表达。他们发现，对幼虫生长相关基因的编辑对害虫起到致命的作用。并且研究还开创了一种有效的显微注射方法，在注射后，死亡率大大提升。endprint
近期，主要由埃及伊蚊传播的寨卡病毒在南美，尤其在巴西大爆发。目前生物技术公司Oxitec已经研发出转基因蚊子。他们通过基因编辑技术将Oxitec基因插入蚊子体内，使得其后代未成为成虫就死亡。转基因的埃及伊蚊在被放入野外后与雌蚊交配，产生的后代无法活到成年。该公司试验点的蚊子能减少90%。这是直接将基因编辑技术应用到害虫防治领域的一次尝试，其结果显示基因编辑作为一种新的害虫防治手段具有可行性。
3 基因编辑技术在害虫防治方面的应用前景及问题
基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9为昆虫学家提供了一种控制害蟲的新方法。通过基因编辑技术能产生新基因型或产生与其他昆虫相似的基因型。在对蚊子的研究中，研究者一直在寻找一种消除或改变蚊子表现型的方法[10]。Galizi R等人[11]利用核酸内切酶表达具有组织特异性和阶段特异性的基因，表达该基因的雄性按蚊产生的后代都为含Y染色体的雄性。由此形成了一个性别比例失衡的系统，有效降低了按蚊的种群数量。基因编辑的目的也可能是改变害（下转第42页）（上接第51页）虫的表现型，使之无害。另外利用基因编辑技术，研究害虫基因功能，发现的杀虫剂靶标，也是行之有效的害虫防治策略之一。
基因编辑技术应用于害虫防治上具有很大的潜力，但一项技术被用于实践还要考虑两方面的因素：（1）是否有相应的技术将此系统递送到特定的细胞，并在特定的阶段得到表达。（2）目标物种能否控制交配和筛选过程并进行基因分析。
目前，基因编辑技术缺乏成功的实践范例以及能广泛使用的框架。在一些范例中，最终并没有产生基因突变，未得到预期的效果[12]。对于基因编辑技术，不仅要考虑其有效性，还要考虑对环境带来的影响。这些都还有待进一步研究。
4 结语
利用生物手段对害虫进行控制能有效解决抗药性和化学农药产生的污染等问题，可能是未来害虫防治的主要手段，而基因编辑的效果已在研究阶段得到了很好的验证，相信随着研究的进一步深入，该项技术存在的问题能得到解决并广泛应用到害虫的防治中。同时，我们认为基因编辑技术可以与常规的化学农药联用，在害虫防治中共同发挥作用。
【参考文献】
[1]Merlin C，Beaver LE，Taylor OR，Wolfe SA，Reppert SM.Efficient targeted mutagenesis in the monarch butterfly using zinc-finger nucleases[J].Genome Res 2013，23：159-168.
[2]McMeniman CJ， Corfas RA， Matthews BJ， Ritchie SA， Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans[J].Cell 2014， 156：1060-1071.
[3]Beumer KJ， Trautman JK， Mukherjee K， Carroll D. Donor DNA utilization during gene targeting with zinc-finger nucleases[J]. G3-Genes Genomes Genetics 2013，3：657-664.
[4]Xu J，Wang Y， Li Z， Ling L， Zeng B， James AA， Tan A， Huang Y. Transcription activator-like effector nuclease （TALEN）-mediated female-specific sterility in the silkworm， Bombyx mori[J]. Insect Mol Biol 2014， 23：800-807.
[5]Basu S， Aryan A， Overcash JM， Samuel GH， Anderson MAE， Dahlem TJ， Myles KM， Adelman ZN. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti [J]. Proc Natl Acad Sci U S A 2015， 112：4038-4043.
[6]Gratz SJ， Ukken FP， Rubinstein CD， Thiede G， Donohue LK， Cummings AM， OConnor-Giles KM. Highly Specific and Efficient CRISPR/Cas9-Catalyzed Homology-Directed Repair in Drosophila[J]. Genetics 2014， 196：961–971.
[7]Gratz SJ， Cummings AM， Nguyen JN， Hamm DC， Donohue LK， Harrison MM， Wildonger J， OConnor-Giles KM. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease[J]. Genetics 2013， 194：1029-1035.
[8]Kondo S， Ueda R. Highly improved gene targeting by germline-specific Cas9 expression in Drosophila [J]. Genetics 2013， 195：715–721
[9]Honglun Bi， Jun Xu. CRISPR/Cas9-mediated targeted gene mutagenesis in Spodoptera litura J]. Insect Science， 10.1111/1744-7917.12341. （2015）
[10]Burt A. Heritable strategies for controlling insect vectors of disease [J]. Philos Trans R Soc B Biol Sci 2014， 369：20130432.
[11]Galizi R， Doyle LA， Menichelli M， Bernardini F， Deredec A， Burt A， Stoddard BL， Windbichler N， Crisanti A. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito [J]. Nat Commun 2014， 5：3977.
[12]Araki M， Nojima K， I shii T. Caution required for handling genome editing technology [J]. Trends Biotechnol 2014， 32：234-237.
[责任编辑：朱丽娜]endprint
